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利用温控近红外光谱研究限制环境下蛋白质的热稳定性及水的作用

文章中利用反胶束模拟限制环境,采集了不同温度下蛋白质溶液及反胶束溶液的近红外光谱。通过化学计量学方法对光谱进行解析,发现限制环境下蛋白质的热稳定性显著提高,并且发现了特殊桥连水结构的存在可能是其热稳定性提高的原因之一。

摘要

针对限制环境下蛋白质与水的相互作用问题,邵学广教授课题组进行了深入的研究。文章中利用反胶束模拟限制环境,采集了不同温度下蛋白质溶液及反胶束溶液的近红外光谱。通过化学计量学方法对光谱进行解析,发现限制环境下蛋白质的热稳定性显著提高,并且发现了特殊桥连水结构的存在可能是其热稳定性提高的原因之一。

1. 介绍

与蛋白质相关的大多数生物过程往往在限制环境中进行,蛋白质的结构、性质和功能容易受其周围环境的影响,所以蛋白质在限制环境下的稳定性与其在溶液中的不同。影响限制环境下蛋白质热稳定性的主要因素有两种,一种是空间限制带来的排除体积效应,另一种是相互作用,其中蛋白质与水的相互作用对于其热稳定性的影响尤其重要。但目前关于限制环境下与蛋白质相关的水结构研究较少,因此还需要更深入的研究。

近红外(NIR)光谱已被广泛应用于水的结构研究。反胶束(RM)作为一种常用于模拟限制环境的工具已经被科研工作者广泛应用。所以,在本研究中利用温控近红外光谱研究含有蛋白质反胶束中的水结构,并以此来了解限制环境中水与蛋白质的相互作用。在不同温度下测量了蛋白质水溶液和反胶束溶液的近红外光谱,利用连续小波变换(CWT)提高分辨率,分析蛋白质和水随温度的结构变化。而后采用主成分分析(PCA)研究限制环境下水结构的光谱,并通过观察其随扰动的变化来推测反胶束中影响蛋白质稳定性的关键水结构。

2.材料及方法

2.1 样品制备

将牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)和卵清蛋白(OVA)溶于二次蒸馏水中配置成蛋白质水溶液。

将双(2-乙基己基己基)磺基琥珀酸钠(AOT)溶于异辛烷(IO)配成AOT/IO混合溶液。而后将其与水或蛋白质水溶液充分混合,配成反胶束或含有蛋白质反胶束溶液。

2.2 光谱测量

近红外光谱由Vertex 70近红外光谱仪(德国布鲁克光谱仪器公司)测量得到。实验使用卤族钨灯光源和铟镓砷(InGaAs)检测器。获得的光谱的分辨率为4 cm-1,波数范围为4000-12000 cm-1,并以空比色皿的光谱为背景光谱。为了提高信噪比,每次实验数据均经过64次扫描。

仪器的温度控制由含有2216e控温配件的装置(德国布鲁克光谱仪器公司)实现,控制温度的准确度为±0.1 oC。对于每个样品,测量时升温范围控制在35-80 oC,升温间隔为5 oC。每个样品在测量前均在该温度下保持30分钟以达到热力学平衡状态。

2.3 数据处理方法

连续小波变换(CWT)通常用来消除光谱中变动的背景和加强光谱的分辨率。本文中,使用“Sym4”小波基,尺度选择为20能够达到较好的平滑和消除噪声的效果。

主成分分析(PCA)用于处理NIR光谱数据后可以获得载荷和得分信息。载荷表示光谱特征,得分表示载荷的权重。因此,利用载荷来分析水结构组成,利用得分用来分析结构随扰动的变化。

3. 结果与讨论

3.1 光谱分析

对于光谱的分析主要集中在6900 cm-1处OH伸缩振动的一级倍频信息及4600-4900 cm-1附近蛋白质酰胺基团的信息。但由于反胶束中6900 cm-1处水的信息较少以及4600-4900 cm-1附近酰胺基团信息被周围水的强吸收掩盖,于是采用CWT提高分辨率。在Fig.1(a)中观察到了非氢键(NHB)、弱氢键(WHB)和强氢键(SHB)水结构的信息。Fig.1(b)中观察到α-螺旋和β-折叠结构的信息。后续工作将通过上述峰的强度变化来反映对应蛋白质和水结构的含量变化。

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Fig.1 近红外原始光谱和CWT光谱。

3.2 反胶束中蛋白质的稳定性

为了观察反胶束中蛋白质的结构变化,研究了α-螺旋随温度升高的变化。Fig.2(A)显示了三种蛋白质溶液CWT谱中α-螺旋峰强度值的变化。观察三种蛋白质的变化曲线,发现曲线斜率突变的温度分别为65、55和60 oC处,上述温度为三种蛋白质对应的变性温度。Fig.2(B)显示了反胶束和含有三种蛋白质反胶束CWT谱中的变化。比较四条曲线,发现斜率几乎相同,都没有出现拐点,这表明在反胶束中蛋白质并未变性,同时说明反胶束一类的限制能够增加蛋白质的热稳定性。

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Fig.2 α-螺旋结构在水溶液及反胶束中随温度的含量变化。

3.3 含有蛋白质的反胶束中水结构

为了研究反胶束中的水结构随温度的变化,主要分析了非氢键(NHB)、弱氢键(WHB)和强氢键(SHB)水结构的光谱强度变化。Fig.3显示了不同水溶液体系及反胶束体系CWT光谱中三种水结构随温度的变化。观察发现溶液体系的斜率大,而反胶束体系的斜率小,说明反胶束中的水结构比溶液中更加稳定。Fig.3(A)中NHB随温度升高含量线性变化,表明NHB与蛋白质没有相互作用,但在Fig.3(B)、(C)的结果中显示蛋白质溶液中WHB和SHB的变化斜率也在65°C前后发生变化。另外在我们之前的工作中,HSA和OVA也获得了相同结果。综上所述形成氢键水分子的变化与蛋白质有关,能够反映蛋白质结构变化的过程。

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Fig.3 水结构随温度的变化。

为了深入了解含有蛋白质反胶束中的水结构信息,采用PCA进一步计算。Fig.4显示了前三个主成分的载荷和得分。另外图中分别用灰色点线绘制了AOT/IO和水的CWT光谱结果。通过分析Fig.4(A1)、(A2)、(B2)、(B2)的结果,发现第一、二主成分中分别包含了AOT/IO和大体积水的信息。对比Fig.4(A3)中第三主成分的载荷和水的参考光谱,发现6966 cm-1处出现了一个新的峰。考虑到峰的位置,推测其可能是连接在AOT头基与蛋白质之间的水分子。在Fig.4(B3)中,水和反胶束的光谱得分较小,并且得分随着BSA含量的增加而增加,进一步证明上述推论。由此推测这种仅存在于含有蛋白质反胶束中的桥接水结构很可能是反胶束中蛋白质更加稳定的原因。

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Fig.4 蛋白质水溶液和反胶束溶液CWT光谱的PCA结果。(A1-A3)为载荷,(B1-B3)为得分。

4. 结论

将温控近红外光谱与化学计量学方法深度结合的方法已经被证明是提取水溶液体系中隐藏信息的有力手段。该研究利用不同温度下水的NIR光谱变化有效的反映了溶液及限制环境中蛋白质热稳定性的差异,而后又通过PCA进一步分析了可能影响蛋白质热稳定性的关键水结构。

参考文献

Shiying Wang, Mian Wang, Li Han, Yan Sun, Wensheng Cai, Xueguang Shao, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 267(2) (2022) 120581.

https://doi.org/10.1016/j.saa.2021.120581

利用温控近红外光谱研究限制环境下蛋白质的热稳定性及水的作用

邵学广,男,1963年4月,中共党员,博士,教授,博士生导师。1984年毕业于聊城师范学院(现聊城大学)化学系,1987年获中国科技大学分析化学硕士学位,1992年获中国科技大学(中日联合培养)分析化学博士学位。毕业后留校工作,2005年调入南开大学。1995年以来,多次出访法国科研中心、香港理工大学、加拿大英属哥伦比亚大学(UBC)等进行合作研究。兼任《Chemometrics and Intelligent laboratory Systems》、《高等学校化学学报》、《分析化学》等多种期刊编委会委员,中国化学会理事、计算机化学专业委员会和有机分析专业委员会委员,中国仪器仪表学会近红外光谱分会副理事长,天津市分析测试协会副理事长。主要从事化学计量学及其应用研究,对小波分析、免疫算法、独立成分分析等开展了创新性研究工作,在J. Am. Chem. Soc., Acc. Chem. Res., Anal. Chem., J. Comp. Chem.等学术期刊上发表论文350余篇,编著、翻译或合作出版学术著作5部。2002年获国家教育部第三届高校青年教师奖,2003年获国家杰出青年基金,2009年荣获宝钢优秀教师奖,2012年获国务院政府特殊津贴,2018年获中国仪器仪表学会陆婉珍近红外光谱科技奖。

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