该研究提出运用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）结合化学计量学方法快速分析不同地区白术中12种活性成分含量并进行产地判别。首先，使用HPLC-DAD结合二阶校正算法（ATLD）对来自不同地区的白术中12种活性成分同时进行定性定量分析。利用“二阶优势”，12种化合物不仅在12.5 min内快速洗脱，而且还在色谱峰高度重叠的情况下实现了准确定性定量（平均回收率为80.8–109.9%），一系列品质因子参数均反映出所提方法的可行性。基于ATLD解析所得的12种活性成分和31种未校正成分的相对浓度值，使用偏最小二乘-判别分析法（PLS-DA）对不同地理来源的白术样本进行判别分析，三个地区的白术都有明显的聚类趋势，测试集的正确分类率可达90%。变量重要性投影（VIP）分析结果表明，紫丁香酚苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ和苍术酮可作为白术产地判别的主要标志成分。一系列结果均证明了所建立模型的可靠性。该方法的建立有助于白术的临床使用和市场监管。
摘要
今天介绍一篇来自湖南大学吴海龙教授课题组于2022年5月发表在Journal of Chromatography A上的文章。该研究提出运用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）结合化学计量学方法快速分析不同地区白术中12种活性成分含量并进行产地判别。首先，使用HPLC-DAD结合二阶校正算法（ATLD）对来自不同地区的白术中12种活性成分同时进行定性定量分析。利用“二阶优势”，12种化合物不仅在12.5 min内快速洗脱，而且还在色谱峰高度重叠的情况下实现了准确定性定量（平均回收率为80.8–109.9%），一系列品质因子参数均反映出所提方法的可行性。基于ATLD解析所得的12种活性成分和31种未校正成分的相对浓度值，使用偏最小二乘-判别分析法（PLS-DA）对不同地理来源的白术样本进行判别分析，三个地区的白术都有明显的聚类趋势，测试集的正确分类率可达90%。变量重要性投影（VIP）分析结果表明，紫丁香酚苷、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ和苍术酮可作为白术产地判别的主要标志成分。一系列结果均证明了所建立模型的可靠性。该方法的建立有助于白术的临床使用和市场监管。
1、介绍
白术是一种被广泛应用于传统医学领域的药食同源植物，对多种疾病都具有显著的疗效，有补脾健胃、燥湿利水、止汗安胎等功能。此外，白术提取物还具有良好的抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗抑郁和美白皮肤等功效。由于白术的应用价值较高，多地广泛种植白术以满足巨大的市场需求，如浙江、湖南、安徽等地。随着种植区域的不断扩大，不同产区的白术在质量上呈现出较大差异，其所含的活性成分也会因种植区域的不同而有所差异，这将导致市场上的白术参差不齐，质量难以保证。因此寻找一种快速且可靠的分析方法来定量白术中的活性成分和鉴定白术产地具有重要的研究意义。基于此背景，该研究小组采用了化学计量学方法结合HPLC-DAD用于快速测定不同地区白术中的活性成分，并实现了113个白术样本的产地判别。
2、材料及方法
2.1 样品及实验试剂
3天内采集来自三个省份的113个白术样品，其中安徽（AH）45份，湖南（HN）42份，浙江（ZJ）26份，经预处理后写好编号分批装入密封袋，并保存于阴凉干燥的房间待用。
12种活性物质（紫丁香酚苷（SYR ≥ 98%） 、原儿茶酸（DIH ≥ 98%） 、 咖啡酸（CAF ≥ 98%）、阿魏酸（FUM ≥ 98%）、东良菪内酯（SCO ≥ 98%）、7-羟基香豆素（UMB ≥ 98% ）、木犀草素（LUT ≥ 98%）、白术内酯Ⅲ（ATRⅢ ≥ 98%）、白术内酯Ⅱ（ATRⅡ ≥ 98%）、白术内酯Ⅰ（ATRⅠ ≥ 98%）、苍术酮（ATN ≥ 98%）和反式-2,4-癸二烯醛（DDA ≥ 90%））均用甲醇配制成一定浓度的储备液并置于4℃冰箱中保存待用。分别配制10个校正样本、3组预测加标样和3组真实样以此获取白术中12种活性成分的定性定量信息。
2.2 实验方法
使用岛津LC-20AT HPLC-DAD仪器采集上述配制样本溶液及113个白术样本的指纹图谱，然后利用基于交替三线性分解（ATLD）算法提取复杂指纹图谱中目标分析物的相关定性定量信息。最后，在此定量信息的基础上，再结合有监督的PLS-DA法对来自不同地区的113个白术样本进行地理来源判别分析，并通过变量重要性投影（VIP）筛选出重要变量作为标志物。
3、结果与讨论
3.1 原始数据分析及非三线性因素的处理
从图2可看出12种活性物质可在12.5 min内快速洗脱出来，但存在严重的共洗脱现象且白术的实际样本中含有多种未知干扰。另外，由于地区差异，不同真实样本中的未知干扰可变且不可预测，若使用传统的单变量校正方法则难以准确定量。因此，提出了基于ATLD算法的二阶校正方法来解决以上难题。
图2（a）C02的多通道色谱轮廓；（b）C02的二维轮廓；（c）10个校正样和3个预测加标样的单波长(λ = 220 nm)色谱叠加图
在使用ATLD算法时，三维数据阵需具有严格的三线性结构才可获得准确的分解结果。像基线漂移，时间漂移等这类非三线性因素会导致目标分析物的浓度不准确。因此在获取准确的定量信息之前，应对色谱中的非三线性因素进行预处理。在这项工作中，基线漂移可拟成额外的未知干扰成分扣除（如图3），由于ATLD算法对组分数（N）不敏感，因此它非常适合从具有漂移和复杂干扰的数据中提取出待测物的纯信号。
图3 C02样本（260 nm）在区域II的原始色谱图（左）；ATLD算法校正后的色谱图（右）
3.2 三线性成分模型在定性和定量分析中的应用
为便于分析，将12种活性物质分成五个区域，利用核一致诊断法选择出每个区域最佳的组分数N，解析得到的归一化色谱图，归一化光谱图及相对浓度图如图4。从图中可看出尽管分析物间色谱峰重叠严重、吸收波长相似且存在未知干扰，利用二阶校正方法仍可解析得到目标分析物的定性和定量信息。
图4 归一化色谱（I、II、III、IV 和 V-A）、归一化光谱（I、II、III、IV 和 V-B） 和相对浓度图（I、II、III、IV 和 V-C）
三个产地的平均回收率分别为90.0–109.0% (安徽)、85.5–109.9% (湖南)和80.8–103.3% (浙江)。对真实样本进行分析发现，安徽、湖南和浙江地区的白术样本可分别检出9、8和8种活性物质。结果表明，由于土壤和气候的多样性，不同地区的白术在所含活性化合物的种类和含量上存在差异。
4、方法验证
12种分析物的线性相关系数均大于0.99，且F值范围在0.10-2.62之间，明显小于临界值(F0.05（8,10）=3.07)。结果表明，在设计的校正浓度范围内线性令人满意，这为预测样品中分析物实际浓度的准确性提供了保证。另外，为评价所提方法的分析性能，分别计算了灵敏度(SEN)、选择性(SEL)、检测限(LOD)和定量限(LOQ)等品质因子参数。结果显示目标分析物均有较高的SEN和较低的LOD。
5、不同白术样本的产地鉴别
在定量分析基础上，结合PLS-DA对不同地区的白术样本进行地理来源判别分析。从113个白术样本中随机抽取83个样本作为训练集以构建监督分类模型，其余30个样本作为测试集用于评估分类模型的预测能力。基于留一法交叉验证（LOOCV）并结合分类正确率（CCR）值，选择出最佳的潜变量数（LV）为7。此时，训练集、交叉验证和测试集的CCR值可分别达到100%、94%和90%。
使用前两个LV得分值作散点图，观察训练样本在二维空间中的分布情况，如图5所示。可看出尽管湖南地区白术样本的间类差距大，但三种类型的白术样本仍可被正确分类。此外，为进一步评估模型性能，分别计算了灵敏度和特异性等参数。上述一系列结果均表明所建模型可靠且稳健。
图 5 基于PLS-DA前两个LV得分值的散点图
6、结论
本研究采用ATLD算法辅助HPLC-DAD定量分析白术样品中的12种活性物质。借助“二阶优势”，即使存在未知干扰、重叠严重的色谱峰和基线漂移等问题，也可获得可靠的定性和定量结果。根据ATLD算法解析得到的各成分相对浓度结果进行PLS-DA分析，并通过VIP筛选出有助于产地鉴别的化学标志物。总之，该策略有望成为提取复杂中药体系中多目标分析物定性和定量信息的一种强而有力手段。更重要的是，它可扩展到药用植物的产地判别分析，为药材的质量控制提供帮助。
- 参考文献：Tong G Y, Wu H L*, Wang T*, et al. Analysis of active compounds and geographical origin discrimination of Atractylodes macrocephala Koidz. by using high performance liquid chromatography-diode array detection fingerprints combined with chemometrics. Journal of Chromatography A, 2022, 1674: 463121.
- 文章链接：https://doi.org/10.1016/j.chroma.2022.463121
作者简历
吴海龙，1961年生，浙江舟山定海人，湖南大学理学博士、日本千叶大学工学博士，湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室化学教授（二级）、博士生导师，化学生物传感与计量学国家重点实验室创室常务副主任、前主任、学术委员会顾问，湖南大学分析化学国家重点学科建设长期责任人。兼任中国化学会计算机化学专业委员会副主任、有机分析专业委员会副主任、中国仪器仪表学会分析仪器分会常务理事兼化学传感器专业委员会主任等。任《Journal of Chemometrics》、《分析化学》等九种学术期刊编委。长期从事化学计量学方法、化学生物传感技术研制和应用研究，发表研究论文逾320篇，其中SCI论文逾260篇，被引用逾6000篇次，连续二届入选爱思唯尔（Elsevier）年度中国高被引学者榜单，参编著中英文论著9本（6本为科学出版社出版）。多年来在液膜pH化学传感器、稳健统计学新应用、三维数阵分析、复杂体系数学分离、二阶张量校正、二阶标准加入分析及其应用、化学多维校正、化学高维模式识别等方面取得系列创新性成果，其代表性成果是梳理、发展和完善定量分析化学或称作化学测量学的通用基础理论：化学多维多元校正理论、方法、算法及其创新性应用。曾荣获2002年度湖南省科技进步奖一等奖、2003年度国家自然科学奖二等奖、中国化学会第七届分析化学基础研究“梁树权”奖、2019年度中国化学会第二届计算机化学杰出贡献奖等学术奖项。培养毕业博士生26名、毕业硕士生70多名。
王童，男，理学博士，助理教授。1993年生，2020年7月于湖南大学获理学博士学位，同年9月加入湖南大学化学化工学院任助理教授。主要从事化学计量学和化学信息学研究。2015年至今发表论文40余篇，以第一/通讯作者在Chemom. Intell. Lab. Syst.、Sci. China Chem.、Food Chem.、J. Chromatog. A等期刊发表论文17篇，参与1部中文专著编写。
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