今天给大家介绍一篇由西班牙阿尔卡拉大学Maider Greño等人在Food Chemistry（IF=9.231）上在线发表的一篇的研究性文章。该文章提出了一种非靶向代谢组学方法，该方法基于反相液相色谱与高分辨率质谱联用来检测可可粉与一些最常用的可可掺假剂。
今天给大家介绍一篇由西班牙阿尔卡拉大学Maider Greño等人在Food Chemistry（IF=9.231）上在线发表的一篇的研究性文章。该文章提出了一种非靶向代谢组学方法，该方法基于反相液相色谱与高分辨率质谱联用来检测可可粉与一些最常用的可可掺假剂。
1、介绍
可可粉是全世界消费量很高的产品，可以用更便宜的原料替代，从而导致食品欺诈。通常，用于检测食品造假的分析技术基于色谱技术和红外光谱(IR)。近年来，代谢组学策略已经成为了解特定系统的整个代谢组的有力工具。
2、研究亮点
•开发用于搜索可可掺假标记的代谢组学策略。
•进行了样品提取和HPLC-MS分析的优化。
•用最常用的可可掺假物检测可可粉掺假。
•初步确定了17种可可掺假的潜在标志物。
•黄酮类、脂肪酸、萜类和溶血磷脂初步鉴定。
3、结果与讨论
3.1提取过程的优化
由于样品中存在的代谢物性质未知，需要对样品处理进行优化，以获得最大数量的分子特征。
1.采用脱脂、超滤或两者的组合对样品进行净化处理。
2.研究不同溶剂和溶剂组成对代谢产物提取的影响。即使用MeOH、EtOH进行实验。
3.评估了使用超声波浴代替恒温混匀器进行提取的可能性。
4.使用15或30分钟评估了提取时间的影响。
得出最佳萃取条件：萃取前的脱脂步骤，80% MeOH水溶液作为萃取溶剂，恒温混匀器在750 rpm在25℃下30分钟进行萃取。
表1.使用不同萃取溶剂的QC样品中存在的分子特征数量
3.2 HPLC-MS条件的优化
根据最多的分子特征和总离子色谱图(TIC)和基峰色谱图(BPC)的色谱峰分布，对色谱参数进行了优化。除了考察流动相中加入少量改性剂的影响外，还评估了其他色谱参数，如柱温和进样体积，以确保检测到样品中存在的最大数量的代谢物。
未掺杂的可可样品(可可)以及高掺杂量的角豆粉(CARH)、大豆粉(SH)或菊苣(CHH)的正负ESI模式下的基础峰色谱(BPC)如图所示。
图1.在正（左图）负（右图）离子模式下测定了未掺杂和掺有大豆粉(SH)、菊苣(CH)或角豆粉(CAR)的可可样品的基峰色谱图(BPC)。
3.3多元统计数据分析
执行代谢组学序列后，使用MassHunter中的MFE工具进行分子特征提取。使用AgilentMassProfilerProfessional过滤数据后，在正负ESI模式下获得了分子特征。
使用SIMCA14.0软件，进行无监督主成分分析(PCA)以减少大量数据并研究样本组之间最相关的差异。图2显示了在两种ESI模式下使用和不使用QC分析的样本组的PCA得分图。
图2.在有(A)和没有(B)QC的正离子模式下和有(C)和没有(D)QC的负离子模式下得到的主成分分析(PCA)得分图。霍特林的椭圆形代表了95%的置信界限。QC，质量控制；CARH，在可可粉中掺入高含量的角豆粉；CARL，在可可粉中掺入低含量的角豆粉；CHH，在可可粉中掺入高浓度的菊苣；CHL，在可可粉中掺入低含量的菊苣；SL，在可可粉中掺入低含量的大豆粉；SH，在可可粉中掺入高含量的大豆粉。
在进行无监督多变量分析并建立PCA模型后，采用有监督偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对组样本进行判别。
考虑了所有的可可粉样品(COCOA)和掺假可可粉的模拟样品( CARH , CARL , CHH , CHL , SH , SL)，并建立了PLS-DA模型，将不同组的样品与天然可可进行两两比较(COCOA vs CARH , COCOA vs CARL , COCOA vs CHH , COCOA vs CHL , COCOA vs SH和COCOA vs SL)，结果表明，在两种离子模式下，所有组都被分离出来(图2)。
图2.（A）CARH与COCOA，（B）CARL与COCOA，（C）CHH与COCOA，（D）CHL与COCOA，（E）SH与COCOA,(F)SL与COCOA在负离子模式下的偏最小二乘判别分析模型。
模型的质量通过质量参数R2X、R2Y和Q2来证明，如表2所示(R2衡量模型的拟合优度，Q2衡量模型的预测能力)。
表2.PLS-DA模型的质量参数(R2X、R2Y和Q2)和两种ESI模式下交叉验证方差分析的F值和p值。
所有模型，Q2均达到较高的值(>0.952)。此外， F值和P值表明组间分离良好，这也强调了PLS-DA模型的性能。
此外，进行了交叉验证(CV)和置换检验，以证明群体分离是由于样本组中存在不同的代谢物。PLS-DA显示组间分离良好。置换检验中R2、Q2均为正斜率(图3)。得到的模型加强了最初的想法，即样品组之间存在显著差异。
图3.在负离子模式下，（A）CARH与COCOA，（B）CARL与COCO，（C）CHH与COCOA，（D）CHL与COCOB，（E）SH与COCOA，（F）SL与COCOA的置换检验。
为了找到导致可可粉样品和掺假可可粉模拟样品之间差异的变量，使用了PLS-DA模型中的变量重要性投影(VIP)值。为了将研究集中在最相关的代谢物上，选择了两种掺假程度（高和低）的VIP值均高于2的变量进行识别。然后，共获得了正负离子模式下的21个和37个变量。
3.4代谢物鉴定
根据VIP值，选择了21个正离子模式变量和37个负离子模式变量作为可可与菊苣、角豆和大豆粉的可能掺假标志物。
负离子模式下，初步鉴定了黄酮类化合物家族中的四种不同化合物。分别鉴定为槲皮素、木犀草素和芹菜素、7-O-甲氧基异黄酮。正离子模式，可以初步鉴定四种属于溶血磷脂家族的化合物，它们可以被视为可可粉与角豆粉的掺假标记。
总的来说，提出了几种化合物作为可可与一些最常用的可可掺假剂的潜在标记。
4、结论
建立了一种基于HPLC-MS的非靶向代谢组学策略，以揭示可可粉掺入角豆粉、大豆粉和菊苣的情况。初步鉴定了16种负离子模式化合物和4种正离子模式化合物作为潜在可可掺假的标记物。
+ + + + + + + + + + +
参考文献
Maider Greño, Merichel Plaza, María Luisa Marina, Maria Castro Puyana,Untargeted HPLC-MS-based metabolomics approach to reveal cocoa powder adulterations,Food Chemistry,Volume 402,2023,134209,ISSN 0308-8146,
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