Food Control|基于改良内聚稳定同位素比值的燕窝真实性鉴别与定量

摘要

该文针对食用燕窝（EBN）中稳定同位素比值(δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O、δ²H)的高离散性，建立了一种既能定性和又能定量的方法来检测掺入唾液酸、蛋清和食用胶的掺假EBN。通过建立数据处理公式来提高样品同位素比值的内聚性，利用该公式建立欧式距离方程。通过计算欧氏距离建立判别式，预测准确率在95.80% ~ 99.97%之间。此外，建立了3个方程对EBN中掺假物质的含量进行定量分析，相对标准偏差在1.34% ~ 6.31%(n = 6)之间。应用所建立的方法，测得12个实样中有2个样品分别掺入了3.9%的唾液酸和2.9%的蛋清。

1、介绍

食用燕窝（EBN）由金丝燕的唾液制成，其对人体健康有许多益处。EBN的产量较低，但由于市场需求很大，市场上出现了掺假EBN，以获得更高的经济效益。因此，猪皮、银耳、琼脂、食用胶、蛋清和葡萄糖等在外观上类似于EBN的廉价材料，被掺入EBN中以增加EBN的净重。此外，人工生物唾液酸等其他外源物质也会被添加到EBN中。非法掺假不仅严重损害了消费者权益，而且危害了人体健康。因此，有必要开发一种简单实用的方法来鉴别和认证EBN。

本文提出了一种改良的内聚稳定同位素比值的方法对EBN进行鉴定。首先，建立数据处理公式以提高样品同位素比值的内聚性，利用该公式建立欧式距离方程来识别EBN的真实性。然后建立三个代表掺假EBN的参考点（分别掺入唾液酸、蛋清和食用胶），以提高三种掺假类型的判别准确率。最后，建立三个线性方程，在区分掺假类型后预测样品的掺假含量。

2.材料和方法

2.1、试剂和样品

咖啡因和EMA-P1标准物由国际原子能机构（IAEA）提供。从广州海关技术中心获得50份纯EBN样品，这些样品来自中国、印度尼西亚、马来西亚和泰国。使用的掺假EBN样品是通过向纯EBN中添加外源掺假物（唾液酸、蛋清和食用胶）来制备。掺假材料从当地市场购买，包括唾液酸、蛋清（鸭蛋清和鸡蛋清）和食用胶（明胶、果胶和卡拉胶）。

2.2、样品制备

制备42份唾液酸掺假样品、72份蛋清掺假样品、180份食用胶掺假样品、50份纯EBN样品、6份纯唾液酸样品、12份纯蛋清样品和18份纯食用胶样品。

2.3、仪器分析

使用同位素比值质谱仪分别对样品的¹³C/¹²C、¹⁵N/¹⁴N²、H/¹H和¹⁸O/¹⁶O进行分析。样品中的碳和氮元素通过高温燃烧去除和纯化后，硫化物、卤化物和水随后被去除并转化为纯CO₂和N₂气体。样品中的氢和氧元素通过高温裂解转化为H₂和CO气体。CO₂、N₂、H₂和CO气体通过色谱柱分离，然后在IRMS中进行分析。稳定同位素比值用δ表示，单位为“每密耳”(‰)，通式如下：

δX = (R_sample/R_standard) – 1*1000 ,  （1）

其中δ是样品相对于标准品的相对丰度，R表示丰度比。

2.4、改良稳定同位素比值法的建立

为了平衡样品中稳定同位素比值的差异，同时提高鉴别精度，采用基于稳定同位素比值的多元线性方程得出校正系数，建立加权欧式距离公式。计算步骤如下：

（i）掺假样品之间同位素比值的差异用以下公式计算：

A_i,j = X_i,j – X_i+1,j ,  （2）

其中，X_i,j表示第i个样品中同位素比值的第j个指数。

（ii）差分矩阵：

（iii）根据矩阵中列出的多元线性方程，找到未知的A、B、D和E。

（iv）建立加权欧式距离公式，同位素比值由A、B、D和E校正：

y = A*δ¹³C + B*δ¹⁵N + D*δ²H + E*δ¹⁸O ,  （3）

2.5、多维欧式距离判别法的建立

将EBN分别与20%唾液酸，20%蛋清和20%食用胶混合作为参考样品。未知样品和三个参考样品之间的欧几里德距离通过以下公式计算：

其中，D_j是未知样品和参考样品之间的欧式距离，a和b分别表示未知样品和参考样品中校正的稳定同位素比值。

根据不同样品之间的欧式距离，建立了以下判别公式：当D₁<2.87、D₂<2.18、D₃<8.17和D₁>2.87 ∩ D2>2.18 ∩ D3>8.17时，分别定义为距离1（D1）、距离2（D2）、距离3（D3）和距离4（D4）。

2.6、掺假率定量分析方法的建立

将147个掺假EBN的δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O和δ²H值代入公式（3）、公式（4）和SPSS 23的线性回归模块中进行拟合。建立掺假率预测方程，如下所示：

EBN+唾液酸：Y = 1.858*δ¹³C – 1.946*δ¹⁵N – 1.638*δ²H – 17.238*δ¹⁸O + 393.13，

EBN+蛋清：Y = 0.71*δ¹³C + 8.457*δ¹⁵N – 0.872*δ²H – 3.476*δ¹⁸O + 15.826，

EBN+食品胶：Y = 0.05*δ¹³C + 17.975*δ¹⁵N – 3.249*δ²H – 0.064*δ¹⁸O – 164.176，

2.7、统计分析

通过单因素方差分析（ANOVA）分析稳定同位素比值平均值之间的显著差异。Duncan检验用于确定不同样品平均值之间的显著差异（P<0.05）。主成分分析（PCA）由SIMCA 14.1进行分析。使用SPSS 23从非线性、相关性、质心差距和组间差异进行人工神经网络（ANN）、多维标度（MDS）和线性判别分析（LDA）。

3.结果与讨论

3.1、EBN真实性的初步判别模型

3.1.1、基于样品原始数据的判别分析

采用单因素方差分析（ANOVA）对唾液酸、蛋清、食用胶、其他常见掺假物和纯EBN的同位素比值进行分析。结果显示，EBN和各种掺假物之间的显著差异为0.000。然而，EBN的组内差异高达22.0，远远大于EBN与上述三种掺假物质的组间差异。

对50个纯EBN样品和23个掺假样品进行了传统的建模和判别。通过主成分分析(PCA)得分图可以看出（图1A），在第一主成分中纯EBN与掺入低于6%唾液酸和低于25%食物胶的EBN没有很好的区分。质心距多维标度(MDS)分析表明(图1B)，对于掺入少于10%食用胶的EBN鉴别能力较差。由于样本组间和组内的差异，Fisher线性判别（FLD）分析显示（图1C），纯EBN不能很好地与掺入蛋清、低于35%食用胶、低于6%唾液酸的EBN区分开。根据人工神经网络（ANN）模型的非线性关系可以看出（图1D），对EBN是否掺假有较好的鉴别效果，判别准确率为87.8%，但对纯EBN的预测也可能存在误判。因此，对于组内差异较大、组间差异较小的样品，传统的判别方法难以获得较高的判别准确率。

图1 （A） EBN样本分类的PCA得分图；（B） EBN样品分类的MDS图；（C）EBN样品分类的FLD模型（纯EBN，●；EBN + 唾液酸，▲；EBN + 蛋清，■；EBN + 食物胶质，◆）；（D）纯EBN和掺假EBN的ANN模型（纯EBN，■；掺假EBN，■）。

3.1.2、建立基于欧氏距离判断EBN真实性的自变量校正方法

为了研究EBN中稳定同位素比值的离散问题，本文采用Duncan差分法来研究δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O和δ²H值的特性。图2显示了三种纯掺假材料和纯EBN的同位素比值范围。除了在δ¹⁸O值上唾液酸与纯EBN有交叉外，纯掺假材料与纯EBN在其他三个同位素比值上没有出现交叉。

 为了减少同位素比值的离散性，建立了基于一阶多元方程的稳定同位素比值校正方法，并以Y=7.13*δ¹³C-3.09*δ¹⁵N+2.42*δ²H-5.177*δ¹⁸O为判别方法统一了EBN样品的稳定同位素比值。得到纯EBN样品的内聚稳定同位素比值为379.01‰~ 440.3‰。测定三种掺假物质含量的准确率如表1所示，EBN真实性鉴别的准确率基本可以满足实际应用的需要。

为了减少成本和分析工作量，通过删除参数的最小权重来获得最优的确定方法。删除δ¹³C值后，根据2.4节的公式和2.5节的判别式计算准确率（表1）。结果表明，判别准确率总体下降了15%。

图2 （A）纯掺杂材料和纯EBN中的δ¹³C值；（B）纯掺杂材料和纯EBN中的δ¹⁵N值；（C）纯掺杂材料和纯EBN中的δ²H值；（D）纯掺杂材料和纯EBN中的δ¹⁸O值。

表1 δ¹⁵N、δ¹⁸O、δ²H与δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O、δ²H值的判别准确率比较。

3.2、更准确的EBN掺假类型判别模型

为了进一步确定未知样品的掺假类别，提出了基于单点欧氏距离的多维欧氏距离判别法。首先根据四种类型的EBN建立三个参考点，然后根据未知样品到上述三点的欧氏距离实现对掺假类型的判别。

如图3A和图3B所示，初步说明了样品和距离两个变量之间的相关性。如图3C所示，掺有唾液酸、蛋清、食用胶的掺假样品和纯EBN样品分别与D1、D2、D3和D4相对接近。在95%置信区间内建立各样品的ROC曲线（图3D），以证实判别的有效性。AUC值和显著性分析值分别为0.933和0.000，表明该掺假判别方法对EBN真实性的判断具有显著效果。

图3 （A）样品距离频率堆积；（B）样本距离累积百分比的堆积（D1，■；D2， ■；D3，■；D4，■）；（C）样本和距离的CA模型；（D）ROC曲线。

3.3、EBN掺假的定量预测模型

3.3.1、建立不同掺假类型的线性回归模型

根据多变量线性回归（MLR）模型预测未知样品的掺假率。建立以掺假含量为因变量、同位素比值为自变量的MLR模型，确定拟合系数R²。结果显示，该模型同位素比值测定系数R²大于0.998，并在2% ~ 50%范围内存在良好的线性关系。

3.3.2、验证线性回归预测模型结果

掺入唾液酸、蛋清和食用胶的EBN预测准确率分别在97.03%~99.99%、98.42%~99.97%和95.80%~9.94%之间。相对标准偏差 (RSD) 在 1.34%~4.27%、1.43%~5.10% 和 0.20%~6.31% (n = 6) 范围内（表2）。RSD值低于欧盟和我国标准的限值，符合定量预测的要求。

表2 MLR模型检测结果

3.4、实样分析

对从市场上购买的来自印度尼西亚、马来西亚、泰国和未知来源的总共12个EBN样品进行了分析，以进一步确认该方法的重复性和准确性。如表3所示，12个实样中有2个样品中掺入了唾液酸和蛋清，掺入量分别为3.9%和2.9%。

表3 实样分析结果

4.结论

针对目前EBN中存在的各种掺假问题，根据同位素比值(δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O、δ²H)建立了一种能同时鉴别掺假方式和含量的方法。首先建立了稳定同位素比值的加权校正方程，以解决EBN中稳定同位素的离散问题，然后建立方程y=7.13*δ¹³C-3.09*δ¹⁵N+2.42 *δ²H-5.177*δ¹⁸O，得到纯EBN值为379.01‰~440.3‰。然后分别计算未知样品到三个参考点的欧氏距离实现对掺假类型的判别。对于掺入唾液酸、蛋清和食用胶的EBN，判别准确率>99%的指标分别为：D1<2.87、D2<2.18、D3<8.17。最后，根据三种掺假物质的掺入量与稳定同位素比值的关系，建立了三个预测方程。结果表明，掺入唾液酸、蛋清和食用胶的EBN预测准确率分别为97.03%~99.99%、98.42%~99.97%和95.80%~99.94%。对实样分析时，12个样品中的2个样品被鉴定为分别掺有3.9%唾液酸和2.9%蛋清。因此，只需在判别工具中输入样品的稳定同位素比值(δ¹³C、δ¹⁵N、δ¹⁸O、δ²H)，就可以快速了解EBN的真实性、掺假的类型和含量。

参考文献：

• Minjie Zhang, Haoxin Hu, Guangfeng Zeng, Yongyi Tan, Hongtao Lei, Yuanming Sun, Riming Huang, Xiaoqun Wei, Food Control 140 (2022) 109111

• 文章链接：https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2022.109111