稳定同位素和生物元素辅助含硫化合物的中国大蒜产地溯源

摘要

今天介绍一篇由来自农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室的聂晶和袁玉伟等人于2022年6月发表在Food Chemistry 上的一篇文章。该研究对我国六个省或主要产区栽培的大蒜样品进行了稳定同位素（δ¹³C、δ²H、δ¹⁸O、δ¹⁵N和δ³⁴S）、生物元素含量（%C、%N和%S）和含硫化合物（8种含量硫成分和2种氨基酸）的表征。并利用这些特征建立了两种模式识别模型（PLS-DA和k-NN），为鉴定我国大蒜的起源提供了一种有用的方法。

1. 介绍

大蒜自古以来就是一种常见的作物。在全球范围内，由于其独特的营养特性和诱人的风味，它被广泛用作各种形式的蔬菜或调味品（干颗粒、粉末、切碎或整体）。我国不仅是全球最大的大蒜生产国，也是最大的消费国和出口国。2019年，收获了2330万吨大蒜，出口176万吨，约占全球总消费量的80%。因此，对我国大蒜的地理来源的准确鉴别就显得尤为重要，这有助于维护我国大蒜产品的声誉以及为安全和质量提供基本保证。

稳定同位素往往是研究地理来源、食品溯源和验证研究的重要工具。其不仅提供了农产品的地理信息，还使科学家能够了解植物与土壤和人类影响的复杂关系。在本研究中，除了使用常见的C/N/O/H稳定同位素，还引入了S稳定同位素作为表征大蒜地理起源的有效补充。因为大量的研究表明，不同生长区域的大蒜的硫稳定同位素存在显著差异。此外，为改进我国大蒜产地验证，还引入了生物元素（C，N，S）和含硫化合物等特征。通过对之前大蒜的研究已经注意到，含硫化合物是大蒜中常见的成分，并且在不同地区差异很大。

本研究的目的是利用多种稳定同位素（δ¹³C、δ¹⁵N、δ²H、δ¹⁸O和δ³⁴S）、生物元素（%C、%N和%S）和含硫化合物（8种有机硫化合物和2种氨基酸）对我国主要产区采集的大蒜样品进行表征。根据产地信息，探讨大蒜硫含量、硫同位素、含硫化合物丰度和含硫化合物硫含量之间的关系。最终，利用化学计量学构建了一个能够对我国不同生产地区的大蒜进行分类的判别模型，以防止地理欺诈。本研究改进了我国大蒜地理标识数据库，为我国大蒜原产地验证系统提供了框架。

2. 材料和方法

2.1 样品和预处理

从我国东北部的黑龙江省（HLJ，n=40）和辽宁省（LN，n=32）采集了72份样品。其余170个样本收集自中国北部的河北省（HeB，n=25）、河南省（HeN，n=39）、山东省（ShD，n=65）和江苏省（JS，n=41）。样本点地图如图1所示。

图1 中国大蒜具体大蒜采样点信息。

生物元素和稳定同位素分析：将去皮的大蒜鳞茎压碎，在液氮中冷冻，在SCIENTZ-10ND/冷冻干燥器（SCIENTZ，China）中冷冻干燥直至冻干，然后使用SCIENTZ-48研磨机（SCIENTZ，China）研磨成细粉，并通过60目筛。均质粉末储存在干燥器中，直到分析。

含硫化合物分析：将去皮的大蒜鳞茎全部冷冻在液氮中，然后放置在冷冻干燥器中直至冻干。干燥的鳞茎被磨成细粉，并通过60目筛。均化后的粉末储存在低温冷冻柜中−80◦C直到分析。

2.2 统计分析

使用SPSS 18.0软件包（SPSS Inc., USA）进行单向方差分析（ANOVA）、皮尔逊相关和k近邻分析（k-NN）。使用Multi Experiment Viewer（MeV, ver 4.9.0）软件构建层次聚类分析（HCA）。使用SIMCA-P软件（ver. 13.0, Sweden）进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。采用单因素方差分析和邓肯方法确定不同组之间的显著性。使用PLS-DA和k-NN等监督模式识别方法构建地理起源模型。使用三个常数自动优化k-NN模型，以最大化算法。采用留一交叉验证方法来确定每个模型的准确性。

3. 结果与讨论

3.1 生物元素、稳定同位素和含硫化合物分析

在本研究中，研究了大蒜中发现的生物元素（%C、%N和%S）、稳定同位素（δ¹³C、δ²H、δ¹⁸O、δ¹⁵N和δ³⁴S）和一些含硫化合物（8种有机硫成分和2种氨基酸）。表1列出了每个分析物的范围、中位数、平均值和标准差，表2显示了这些变量与地理因素（海拔、经度和纬度）之间的关系。

表1 不同地区大蒜的生物元素、同位素和含硫化合物（mg/100g干重）的范围、中位数、平均值和标准差（SD）。

注：同一列中不同字母标记的值表示基于方差分析的统计显著差异（p<0.05）。

表2 (a)不同地区大蒜含硫化合物与% S和δ³⁴S值的Pearson相关性(b)不同地区大蒜含硫化合物与% S值的Pearson相关性。

注：皮尔逊相关度量相关性的强度，*或**表明一个变量分别对p<0.05或p<0.01显著。

3.2 硫含量与同位素的关系

首先，对所有大蒜样品的大蒜硫含量、硫同位素和含硫化合物含量进行了皮尔逊分析。结果表明，这些化合物之间没有相关性，因为每个成对变量的系数很低（在−0.004和0.12之间）。然后根据地理来源对数据进行分类并重新分析（表2a）。值得注意的是，不同地区的含硫化合物与硫含量无关，但S-脱氧中间体（SMC和SPC）和蒜氨酸与硫同位素呈负相关。HLJ、LN、JS和ShD大蒜的蒜素含量高于其他地区，但硫同位素值较低（表1）。尤其是位于中国东北的HLJ和LN的大蒜，其硫同位素值最低。这一趋势确立了大蒜的地理来源与硫同位素之间的相关性。

最后，比较了含硫化合物中的硫含量和大蒜中的硫含量（表2b）。含硫化合物的硫含量与大蒜硫含量有显著关系；其中，GSAC、大蒜素和大蒜素具有较高的相关性（r>0.5），系数分别为0.561、0.620和0.644（p<0.01）。这些化合物具有不同的ACSO途径，因此在大蒜中含量较高。

3.3 大蒜的化学计量学地理起源判别

在本研究中，使用HCA、PLS-DA和k-NN对大蒜数据进行了无监督和有监督模式识别。共调查了18个变量，包括生物元素含量、稳定同位素和含硫化合物。HCA是一种无监督的模式识别，用于根据18个变量的平均值确定大蒜产地。将6个区域与不同变量相结合，构建了热图（图2）。根据变量确定了两个主要的大蒜簇。第一组包括HLJ和LN大蒜，第二组包括其他区域，这些集群与地理位置一致。HCA结果从数据集中对大蒜起源进行了初步评估，聚类分类与地理分组相似。

图2 基于6个地区大蒜样品的平均稳定同位素值、生物元素和含硫化合物的热图分析。

继而采用PLS-DA和k-NN有监督聚类，并采用留一法进行模型验证。从这两种化学计量学聚类方法中建立了四个模型。首先将稳定同位素和生物元素含量结合起来，构建判别模型。验证结果如图3a和图3b所示。对最近邻法（k-NN）的欧几里得距离进行了评估。在该模型（模型1，图3a）中，对k进行了优化，最终的值为3，表示用最接近的3个大蒜样本来计算每个未知大蒜样本的分类。使用该方法，大蒜产地的总体判别准确率为65.2%，除HLJ大蒜的判别准确率为100%外，大多数地区的准确率在50%-70%之间。PLS-DA是一种常用的参数化方法，用于确定大蒜的来源精度。PLS-DA模型（仅基于稳定同位素和元素含量）生成参数R²X、R²Y和Q²，分别为0.770、0.408和0.374，各产地的个体鉴别准确率在58.5% (JS) ~ 100% (HLJ)之间，HeB、ShD、HeN等大部分产地的大蒜鉴别准确率在72.0%左右。

为了提高判别准确率，将含硫化合物添加到现有的同位素和元素变量中。然后利用所有这些变量构建k-NN模型(模型3，图3c)。本次将k计算为4，模型的总判别准确率为87.8%，最大值为100% (HLJ)，最小值为79.5% (HeN)。采用所有变量的PLS-DA模型(模型4，图3d)，从原始数据(R²X = 0.812)中提取更多的信息，共得到9个潜在变量。R²Y和Q²参数分别为0.631和0.545，为该模型提供了足够的可预测性。前两个潜变量的VIP图如图4a和图4b所示。δ²H、S-alk(en)yl-cysteines(SMC、SAC和SPC)、δ¹⁸O和游离氨基酸(Met、Cys)是构建PLS-DA模型的重要变量，尤其是δ²H和S-alk(en)yl- cysteines。模型4的得分加载图(双标图)将个体变量与地理来源联系起来(图4c)。双标图同时可视化分数质心和加载图，以解释个别变量的观察结果。可以看出，LN大蒜对蒜素、% S和% n反应灵敏，而HeB和ShD大蒜对GSMC、蒜素、% C、δ³⁴S、δ²H和δ¹⁸O反应灵敏。HeN大蒜与蛋氨酸和δ¹⁵N相关。JS的大蒜与SAC和Met有关。该模型交叉验证的总判别准确率为93.4%，最大和最小判别准确率分别为100% (HLJ)和82.1%(HeN)。

图3 判别模型混淆矩阵(a)基于所有稳定同位素和元素含量的k-NN模型(b)基于所有稳定同位素和元素含量的PLS-DA模型(c)基于含硫化合物与稳定同位素和元素含量结合的k-NN模型(d)基于含硫化合物与稳定同位素和元素含量结合的PLS-DA模型。绿色方块表示模型识别正确，橙色方块表示模型识别错误。

图4 基于含硫化合物结合稳定同位素和元素含量的PLS-DA图（a）第一个潜在VIP图（b）第二个潜在VIP图（c）分数加载图（双标图）。

结果表明，添加含硫化合物变量显著提高了PLS-DA精度。k-NN是一种简单的非参数分类方法，因此该方法不如PLS- DA精确。只有一半的研究区域使用k-NN的准确率为60%。然而，当含硫化合物加入时，模型3的k-NN精度较模型1有很大提高，整体识别率提高了至少20%。PLS-DA对模型4的鉴别精度也高于模型2，除LN大蒜的鉴别精度低于模型2约6%外。总的来说，两种监督化学计量技术在补充添加含硫化合物后改进了地理分类模型。

4. 结论

我国不同地区大蒜的同位素和元素空间分布格局不同，可为提高我国区域大蒜的溯源和鉴定水平提供参考。东北地区的大蒜C含量较低，N和S含量较高。这两个地区的大蒜含有较多的含硫化合物，特别是SAC、SPC和Cys。HLJ大蒜的δ2H值明显低于其他地区。HeB和HeN的δ15N值偏负，而HeB、ShD、HeN和JS的δ34S值偏正。生物元素和稳定同位素与地理因素，尤其是纬度的相关性较高。此外，一些含硫化合物的含量与不同地区的硫同位素之间存在明显的关系，GSAC、alliin和alliicin与大蒜含硫量的相关性较高。最后，含硫化合物提供了额外的识别辅助，并提高了基于稳定同位素和生物元素的PLS-DA和k-NN两种监督模式识别模型的准确率，总体准确率分别为93.4%和87.8%。采用同位素、元素和硫化合物多变量结合的方法对大蒜产地进行精细鉴定，可以提高我国大蒜产地的识别度，减少产地误标，增加特定地区大蒜的价值。

参考文献

• Nie, J.; Weng,R.;Li,C.; Liu,X.; Wang,F.;Rogers, K. M.;Qian，Y.; Zhang,Y.;Yuan,Y. (2022). “Chemometric origin classification of Chinese garlic using sulfur-containing compounds, assisted by stable isotopes and bioelements.” Food Chemistry 394: 133557.

作者简历

袁玉伟：1975年生，博士，研究员，主要从事农产品质量安全、农产品风险评估与溯源技术研究。现任浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所总支书记、副所长，农产品及加工品质量安全监督检验测试中心（杭州）副主任。兼任中国食品科学技术学会食品真实性与溯源分会第一届理事会常务理事，农业农村部农产品营养标准专家委员会委员，国家检验检测机构资质认定评审员/农业农村部质检机构评审员。2017年新西兰GNS国家同位素中心访问学者（IAEA资助）。北京工商大学、浙江工业大学、青海大学等高校硕士研究生导师。获得山东省科技进步奖二等奖1项，发表论文61篇（SCI 24篇），其中影响影子5.0以上的16篇，TOP期刊15篇，2篇论文入选ESI前1%高被引，出版著作5部，主译图书《食品溯源与识别分析技术》获得2019年中国石油和化学工业优秀出版物奖-图书奖二等奖。

聂晶：博士，助理研究员，目前任职于浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，主要从事特色农产品（中药材、蔬菜、牛肉等）的产地溯源及鉴别研究，包括分析技术的研发（GC/LC/EA-IRMS，ICP-MS等）和溯源机理机制解析等。近年来主持或参与中国博士后科学基金、浙江省基础公益研究计划项目、国际原子能机构区域合作项目等多项课题，以第一作者发表论文多篇，其中Top期刊论文3篇。